运输和保存：

视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。

1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。

2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。

实验报告：

一、分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，*将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，*在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM，常温条件下离心5分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，吹打均匀后，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO摇匀后进行冻存。

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